Dengue Hemorrágica -saiba tudo sobre o vírus

Dengue Hemorrágica - saiba tudo sobre o vírus



Chunlin Zhang

Department of Virology, United States Army Medical Component —

Armed Forces Research Institute of Medical Sciences, Bangkok, Thailand



Introdução

A importância do vírus da dengue como agente causador da doença, da febre, febre hemorrágica da dengue e da síndrome do choque tem se tornado cada vez mais reconhecida. A prevalência global da dengue tem crescido dramaticamente nas últimas décadas e a doença é agora endêmica em mais de 100 países. Atualmente estima-se que 50-100 milhões de casos de dengue ocorrem a cada ano em países tropicais e subtropicais, quando a incidência da mais grave manifestação da doença, febre hemorrágica da dengue e síndrome do choque da dengue, também está em aumento. Epidemia de dengue é agora caracterizada em todo o mundo por hiperendêmica, ou a co-ocorrência de vários sorotipos de dengue na mesma localidade. Devido à falta de uma vacina ou uma cura para a dengue, é importante o desenvolvimento de métodos diagnósticos eficazes e vigilância laboratorial para a detecção precoce da infecção e para fornecer um sistema de alerta precoce de epidemias de dengue. Assim agora, um bem-desenvolvido método de laboratório de biologia molecular, transcriptase reversa

reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) tem sido amplamente utilizada para a detecção de todos os quatro sorotipos do vírus da dengue (DENV). O diagnóstico da infecção pelo vírus dengue por RT-PCR é baseada na amplificação de regiões específicas do genoma do DENV, seguido por eletroforese em gel de agarose e visualização dos produtos sob luz ultravioleta luz após a coloração do DNA com brometo de etídio.

O método de tipagem molecular DENV, RT-PCR, descrita por Lanciotti (Lanciotti

et al., 1992) tem sido utilizado em nosso laboratório por mais de 10 anos. No entanto,

têm-se observado alguns resultados não-específicos quando se usa este RT-PCR para detectar a infecção. Por exemplo, algumas amostras apresentaram evidências de múltiplas infecções por dois diferentes sorotipos da dengue - na maioria dos casos, DENV-1, mais um outro sorotipo. Além disso, algumas amostras deram resultados positivos para o DENV-1 através de testes sorológicos, ou apresentaram um fragmento de DNA do tamanho correto após a primeira rodada de amplificação de PCR, mas negativos resultados pela PCR. Estes resultados não-específicos interferiram com nossa capacidade de detectar com precisão a infecção com essa técnica, e nós estamos determinados a resolver os problemas encontrados.

Desde que o GenBank database não contém informações suficientes de seqüência

para permitir o alinhamento da seqüência de análises necessárias para o desenho de novos primers para detectar variantes tailandeses DENV, foi necessário estabelecer uma seqüência adequada para as variantes da Tailândia no banco de dados. Recentemente, seqüenciaram o gene do envelope de 325 DENV isolados (98 DENV-1, 105 DENV-2, 68 DENV-3 e 53 DENV-4) e o completo genoma de DENV isolados 32 (10 DENV-1, 10 DENV-2, 6 DENV-3 e 6 DENV-4) obtidas de pacientes tailandês durante 1973-2002, em um estudo molecular do epidemologia da circulação do DENV na Tailândia, para as últimas três décadas. Nossos dados estabeleceram um banco de dados da seqüência de variantes tailandeses DENV, que servirá de recurso para a pesquisa sobre DENV em todo o mundo. Com base nas informações sobre as seqüências de DENV no

nosso banco de dados,nós modificamos de Lanciotti ‘s RT-PCR (Lanciotti et al., 1992) para detectar DENV variantes tailandesas. Aqui nós descrevemos algumas das modificações realizadas.





Material e métodos



Extração de RNA: RNA viral foi extraído de soro utilizando o reagente TRIzol ®

(Invitrogen, Life Technology), de acordo com as instruções do fabricante.



Primers: primer de Lanciotti D1, D2 e primer reverso, TS1, TS2, TS3 e TS4 foram utilizados. Dois novos primers reverso, D2n e TS4n foram concebidos com base

em seqüências de DENV tailandês em nosso banco de dados de seqüência. O primer TS1bis ,previamente descrito por Reynes et al. (2003), também foi utilizado neste estudo.



RT-PCR: RNAviral genômico foi convertido em cDNA com transcriptase reversa

do vírus mieloblastose aviária (AMV RT, Promega) e um primer D2 reverso ou

D2n, de acordo com o método Lanciotti de RT-PCR. A primeira rodada de PCR, produziu 511 pares de bases (pb) e 656 fragmentos de DNA foram amplificadas utilizando bp AmpliTaq DNA polimerase e D1/D2 pares de primers (Figura 15), e D1/D2n (figura 17), respecvamente. Estes produtos de PCR foram amplificados a partir de uma região que está entre o capsídeo e genes Prem.



Nested (aninhado)PCR: O tipo específico de fragmentos de DNA para DENV-1 (482 pb), DENV-2 (119 pb), DENV-3 (290 pb) e DENV-4 (392 pb, amplificados com o par de primers D1 / TS4, ou 389 pb amplificado com um par de primers D1/TS4n) foram amplificados por AmpliTaq DNA polimerase utilizando o produto da PCR na primeira rodada (a 656 pb ou a 511 fragmentos de DNA ) como um modelo(template), com pares de primers mistas (uma para a frente primer D1 e quatro primers inversos: ou TS1bis TS1, TS2, TS3, e TS4 ou TS4n) o PCR foi aplicado(a segunda rodada de amplificação).



Eletroforese em gel: Os fragmentos de DNA amplificados pela PCR foram carregados

1,5% em um gel de agarose e submetidas à eletroforese seguido por coloração do gel com brometo de etídio. O DNA (incluindo bandas de DNA específicas para cada sero-

tipo) foi visualizado sob luz ultravioleta.



Fig.14.



Resultados e discussão



Usando um novo primer reverso para a amplificação de PCR da DENV-1. Alguns dos nossos DENV-1 isolados deram resultados negativos por PCR Lanciotti, mas os resultados positivos pela primeira rodada-PCR (Figura 14) e testes sorológicos (dados não mostrados).Percebemos que tinha sido relatado que a RT-PCR Lanciotti de não detectou a variante DENV-1 em Camboja, devido à presença de uma mutação de ponto (Reynes,etal.,2003).É provável que tenha enfrentado o mesmo problema para a variante DENV-1 na Tailândia.

O alinhamento da seqüência para estas amostras (Figura 14) mostrou que há algumas inadequações entre as seqüências de DENV-1 tailandeses e o primer TS1. Em particular,um ponto de mutação ocorreu no final 3 do primer TS1, que tem, assim, uma redução sensível na detecçãode algumas variantes de DENV-1 tailandesa PCR(Figura15,

secção B).

Esta mutação de ponto está localizado na base do penúltimo final 3 do

primer reverso TS1 (Figura 14) e, portanto, afeta muito a eficiência de ligação da DNA

polimerase, resultando na ampliação vencida e os resultados negativos pela nested

PCR (Figura 15, seção B). Para eliminar essa mutação, um novo primer reverso, TS1bis, desenhado por Reynes et al. (2003), foi utilizado para substituir o original (TS1),na PCR para detectar DENV-1 (figura 14). Nove amostras que eram conhecidos por serem positivas para DENV-1, isoladas de Kamphaeng Phet (KPP) hospital (norte da Tailândia),

foram testados usando o primer original TS1 e o novo primer TS1bis no mesmo

DNA modelo na PCR (Figura 15, as seções B e C). O fragmento de DNA 482 bp foi observado quando TS1bis foi utilizado (Figura 15, secção C), mas não quando TS1

foi utilizado (Figura 15, seção B). Nossos dados demonstram claramente que o primer TS1bis foi mais capaz de detectar a variante tailandesa DENV-1 que TS1.



Eliminação de 511 bpda banda de DNA de interferência da primeira rodada de amplificação por PCR: Na detecção de infecção com DENV pelo Lanciotti RT-PCR (Figura 16), um

fragmento de DNA de 511 pb gerados na primeira rodada de PCR interferiu nos resultados da segunda PCR para as amostras que foram positivas para

DENV-2, DENV-3 e DENV-4 e tinha uma carga viral elevada (figura 17). Os resultados assim erradamente pareceram mostrar evidências de infecções multi-sorotipo. Estes resultados ambíguos foram causados pela pequena diferença de tamanho entre 511 pb, produto da primeira rodada de PCR e os 482 bp DENV-1 da segunda

rodada de PCR. A diferença de 29 pb entre os dois fragmentos de DNA não pode ser

distinguida facilmente por eletroforese em gel de agarose 1,5% com um tempo curto de corrida.

Nós projetamos um novo primer reverso D2n, para substituir a original, D2, da

primeira rodada de PCR. A posição deste primer reverso novo foi deslocado em 145 bases jusante(trás) daquele do primer D2reverso original, resultando em um produto de 656 bp na primeira rodada de PCR. (Figura 18). A diferença de tamanho entre os produtos da primeira rodada da PCR e do DENV-1 do produto da PCR foi de 174

pb, que foi suficiente para diferenciar os dois fragmentos de DNA em gel de agarose. Nossos resultados mostraram que os dois fragmentos de DNA podem ser claramente separados usando D2n, o primer modificado na PCR na primeira rodada e foi eliminado as interferências (Figura 19).



Desenhando de um novo primer reverso para a detecção de DENV-4 na PCR, para evitarproblemas com a variante tailandesa DENV-2: Amostra D2Th0551/03, isolada de um paciente tailandês em 2003, deu um resultado positivo para infecção de DENV-1, DENV-2 eDENV-4 de acordo com RT-PCR é Lanciotti, enquanto só deu um resultado positivo para o DENV-2- de acordo com o teste sorológico. Será que realmente o paciente tem uma infecção concomitante com

múltiplos sorotipos ou foi apenas um resultado não-específico?

Após o alinhamento da seqüência para análise, verificou-se que o primer TS4 tipo específico liga-se à seqüência do

D2Th0551/03 em posições de nucleotídeos 497-512 (Figura 20), o que poderia explicar

o resultado não específico para DENV-4. O resultado aparentemente positivo para o DENV-1foi provavelmente causado pela presença do fragmento de DNA 511 pb do primeiro turno da PCR.

Para testar nossa hipótese, nós projetamos um primer TS4 novo TS4n,

cuja posição foi mudada duas bases a montante (fente) (figura 21). Amostra D2Th0551/03 foi re-testada usando primers D2, D2n, TS2, TS4 TS4n em ambos os PCRs(figura20).

Três produtos de DNA de tamanho esperado para o DENV-1, DENV-4 e DENV-2 foram observados (figura 22, travessa 3) quando Lanciotti primers foram utilizados. Contudo, o fragmento de 511 pb foi eliminado quando D2 primer foi substituído por D2n (Figura 22, as pistas 4 e 5. O fragmento de DNA não-específicas (393 pb) para DENV-4 foi removido quando TS4 primer foi substituído por TS4n (Figura 22, pista 5). Estes resultados confirmam a hipótese.

Nossos resultados indicam que, em vista da variação geográfica e temporal na sequencia deDENV, uma sequencia de banco de dados para os vírus que circulam em uma determinada localidade, deve ser estabelecida, a fim de servir como fonte de informação para a concepção de

primers específicos e sensíveis ou sondas para o diagnóstico e vigilância dos den-

gue por abordagens moleculares em laboratório.